顯色是
ELISA檢測試劑盒中的后一步溫育反應(yīng),此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴格控制,有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色狀況適當縮短或延長反應(yīng)時間及時判斷。
ELISA檢測試劑盒實驗中顯色十分重要，當ELISA沒有顯色，可能原因有這幾個方面：
1.包被原：包括你的包被液有無問題，有沒有配錯。包被原一般加100微升，37度2小時；
2.封閉：封閉液用的是否適合？你說做了幾次都沒顯色，空白孔也不顯嗎？如果空白也無顏 色，那封閉就沒有問題。一般封閉是200微升每孔，也可以滿孔封閉
3.一抗：檢查你的一抗是否失效。是否是在37度反應(yīng)
4.二抗：底物，底物緩沖液……這些都要好好檢查！
5.洗滌：用PBST洗滌，包被和封閉時洗板3次；一抗二抗洗滌5次，每次間隔3分鐘。手工和機器洗滌沒什么不同，就是省力一些。洗5次不會有負影響，在一抗和二抗洗滌過程中，恰恰需要多洗幾次，這樣有助于減少非特異性吸附。
避免顯色淡靈敏度低，需注意以下幾點：
1、 常規(guī)ELISA試劑盒平衡至30min；
2、 檢測抗體、偶聯(lián)HRP請按說明書稀釋比；
3、 樣本、抗體孵育條件(溫度、轉(zhuǎn)速)，請根據(jù)說明書；
4、 控制TMB底物顯色時間。
